crispr cas9怎么达到基因敲除的

1. crispr cas9怎么达到基因敲除的

近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。

科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术

这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。

那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？

CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。

2. crispr cas9基因敲除原理是什么？

基本原理：CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。
前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。

基因编辑技术形式有：
1、同源重组
同源重组（Homologous recombination）是最早用来编辑细胞基因组的技术方法。同源重组是在DNA的两条相似（同源）链之间遗传信息的交换（重组）。
2、核酸酶
基因编辑的关键是在基因组内特定位点创建DSB。常用的限制酶在切割DNA方面是有效的，但它们通常在多个位点进行识别和切割，特异性较差。为了克服这一问题并创建特定位点的DSB。

3. CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 1

 这里我们先前已经完成： CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计    1.输入目标基因组DNA序列   我们提供在线CRISPR设计工具( http://tools.genome-engineering.org ) 可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。或者，可以通过确认任何5’-NGG直接上游的20-bp序列手动选择引导序列。   2.用在线工具确定，订购需要的oligos和引物。如果手动确定分裂位点，oligos或引物应该按照fig4b.c设计
    设计ssODN模板（任选） 1 h  我们没有选这个方法--略   3.设计和订购定做的ssODN。   4.重新溶解和稀释ssODN ultramers到终浓度10uM。
   5.为了构建sgRNA表达结构，使用PCR表达cassette（选项A）或 以质粒为基础的步骤（选项B） --我们选择了方案B   （A）通过PCR扩增构建sgRNA表达结构 2 h--没选这个方案，略
    （B）sgRNA cloning进入pSpCas9（BB）质粒，与Cas9共表达 3 d 
                                                                                                                                                                    Pause point：此处理后，反应可以储存在-20℃至少1周 
   感谢师兄DZ

4. CRISPR/Cas9基因敲除，敲入怎么做，原理

5. 如何利用CRISPR来开展全基因组筛选

如何进行CRISPR筛选？

      利用CRISPR文库来开展正向遗传学筛选包括多个步骤。在大多数情况下，CRISPR文库是以极低的浓度提供的。因此，第一步就是将你的文库扩增到一定程度，足以产生慢病毒。记住，你需要使用新一代测序来检查文库的代表性，也就是扩增前后每个gRNA的比例。随后，用含有CRISPR文库的慢病毒转导细胞，产生突变细胞的异质群体，其中每个细胞或每组细胞含有不同基因的突变。

      接着，利用药物选择或基于荧光的细胞分选来富集突变细胞，并筛选特定表型。例如，突变细胞可用在药物筛选中，以鉴定赋予耐药性的基因。具体来说，我们可利用某种药物来处理突变的细胞，并分析耐药性群体与对照相比的gRNA分布。在这种情况下，与突变时赋予耐药性的基因相对应的gRNA可富集起来。根据这一类型实验的结果，可了解细胞耐受药物的机理，有助于确定未来的治疗目标。

6. 如何利用CRISPR来开展全基因组筛选

如何进行CRISPR筛选？

      利用CRISPR文库来开展正向遗传学筛选包括多个步骤。在大多数情况下，CRISPR文库是以极低的浓度提供的。因此，第一步就是将你的文库扩增到一定程度，足以产生慢病毒。记住，你需要使用新一代测序来检查文库的代表性，也就是扩增前后每个gRNA的比例。随后，用含有CRISPR文库的慢病毒转导细胞，产生突变细胞的异质群体，其中每个细胞或每组细胞含有不同基因的突变。

      接着，利用药物选择或基于荧光的细胞分选来富集突变细胞，并筛选特定表型。例如，突变细胞可用在药物筛选中，以鉴定赋予耐药性的基因。具体来说，我们可利用某种药物来处理突变的细胞，并分析耐药性群体与对照相比的gRNA分布。在这种情况下，与突变时赋予耐药性的基因相对应的gRNA可富集起来。根据这一类型实验的结果，可了解细胞耐受药物的机理，有助于确定未来的治疗目标。

7. CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 5-15 转染验证

  CRISPR-Cas9学习笔记     Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记     FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing 
    CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计     CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后     CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 1     CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 2     CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 3     CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 4 
    这里我不再放详细的实验步骤了，因为我的实验记录本已经详细的记录了实验步骤和条件，没有多余的时间再重新弄一个，可以自行回去查找文献对照protocol 
                                            上次我的day 4做完之后，接着就要转293T细胞来验证一下质粒的效果了。简单描述以下前期的思路（其实是我自己在回顾），先准备好需要用的东西：Cas9 backbone质粒，根据基因靶点将sgRNA设计好（顺带设计一下引物），将sgRNA插入到Cas9 backone质粒中，将质粒转入感受态细胞扩增，提取质粒后酶切验证。接着就是293T细胞转染验证了。 
   使用常规的转染试剂Lipofectamine 3000或者罗氏等其他公司的转染试剂，按照protocol严格操作即可。
   昨天和今天都提取了基因组DNA，就酱紫。
   感谢师兄DZ

8. 有人用CRISPR/Cas9系统做细胞基因敲除吗交流下

有人用CRISPR/Cas9系统做细胞基因敲除
是的，确切来说是大量表达。 大肠杆菌是基因重组技术中常用的细菌，将外源目的基因(如人胰岛素基因)导入大肠杆菌后可在大肠杆菌内表达目的蛋白(如胰岛素)，由于细菌繁殖速度快，通过发酵便可在短时间内获得大量胰岛素，再经多步分离、纯化便得到了药用胰岛素。
流程大概是这样的：首先获得小鼠ES细胞系，测试ES细胞嵌合入受体囊胚的能力之后根据不同基因、不同目的设计并构建打靶载体，将打靶载体转入一定数目ES细胞中，然后鉴定出带有发生正确同源重组的突变中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，是的经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，从而得到带有修饰基因的突变小鼠，而后可以对其进行表型分析。