CRISPR 敲除基因的靶位点后插入碱基算成功吗？

1. CRISPR 敲除基因的靶位点后插入碱基算成功吗？

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2. 如何检测 crispr 基因敲除成功

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。

目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。

通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：

Cas9质粒构建

目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：


虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。

3. crispr/cas9 基因敲除，怎样判断grna活性

利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。

4. CRISPR/Cas9基因敲除，敲入怎么做，原理

5. crispr/cas9敲除拟南芥基因后代怎么筛选

载体里有没有抗性基因啊

6. 如何比对crispr/cas9的测序结果

你做的是什么研究，是做单个基因敲除，还是多个基因，还是大批量敲除。如果是使用细胞文库的敲除的话，一般是流式细胞分选，分选出正常基因与被敲除基因，分别对两种基因进行短测序，再进行比对，分析敲除某种基因与不敲除该基因是否对研究课题有影响，然后是有什么样的影响。实验组与对照组的横向比对！

7. crispr/cas9切断以后基因怎么敲除

通过删除或者添加个别碱基，从而破坏基因的编码区，达到敲除的目的。常见的是由于个别碱基的增加或缺失而引起移码突变。

8. crispr测序结果双峰怎么分析

近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前。