干扰RNA的作用原理？

1. 干扰RNA的作用原理？

通过导入与目标基因mRNA部分片段互补的21bp的双链RNA，能够高效引发目的基因沉默，这就是RNAi（RNA干扰）。原理就是，短片段的双链RNA在体内能在酶（Dicer）及相关复合物（RISC）的作用下，变成单链分子，并与目标基因mRNA互补，在Dicer酶作用下，是mRNA发生剪切，转录受抑制或翻译受到抑制，从而在转录水平或转录后水平干扰基因表达。

2. 美国rnai定制分型疗法 治疗尖锐湿疣真的有用吗？真的能三五天彻底消灭病毒吗？还是只是骗钱的？有没

骗钱的，去医院做激光吧，很简单

3. 乙肝能治好吗？目前治乙肝最好的办法是什么

乙肝是一种常见的普通疾病， 现有乙肝病例，绝大多数为慢性病毒携带者（大约80%左右），即便是不吃一片药，多半预后良好，可以平安度过一生；发病状态的乙肝患者，适当给予廉价而有效的治疗，病情大都可以控制；乙肝的传染性虽普遍存在，但是只对婴幼儿、儿童构成威胁，只要他们都注射了乙肝疫苗，乙肝病毒难有威胁。那些少数的、真正的急性乙肝90%都会痊愈，不留下后患。以下进一步阐述乙肝为何是一种普普通通的疾病。 1.乙肝在我国非常普遍、常见，这与我国地域辽阔、民族众多、国民身体素质、遗传特点及对乙肝病毒的易感性有关。根据乙肝的发病特点、症状体征看，很可能该病自古就有，长期以来该病给人类生活带来不少影响和危害，但是这些危害是有限的，绝非灭顶之灾。从全世界来看，西欧美国属乙肝低发区，日本、东欧为中发区，我国及东南亚为高发区，我国乙肝表面抗原阳性者约占总人口数的十分之一，各民族的乙肝病毒表面抗原阳性率各不相同，其中藏族最高（约占总人数的 27%），汉族居中等（大约15%），维吾尔族最低（大约2%），目前全国乙肝病毒表面抗原阳性者一亿三千万以上，根据目前“约定俗成”的惯例，这些人都被戴上乙肝的帽子，这顶帽子很可能是再也摘不掉了。乙肝的这种高发比例，并非今天才有，数十年前（从表面抗原这项指标问世后）我国几次普查结果均大致如此，乙肝的病例数，随着人口基数的增加而增加，源于乙肝病情发展而夺去生命的情况是重型肝炎、晚期肝硬化和肝癌，这三种病变十分严重，但是，真正发展到这步天地的乙肝毕竟只是极少数，一千个乙肝患者约有2—3位最终会发生肝癌，15位最终发展成肝硬化，1.2—2位会发生重型肝炎，其余900多位患者可以安度一生。目前全世界乙肝人数愈三亿，从未听说过乙肝爆发流行，从未听说过由于乙肝引起过某国、某民族、某地区人口寿命降低、死亡率上升，东南亚国家乙肝发病率超过中国，但却看不到人家三天两头在治疗、也从未听到这些国家不断涌现出治疗乙肝的这药那药，东南亚人口寿命还在不断延长。乙肝是一种普通的疾病，和高血压、支气管炎、肾炎等等一样，多数患者都可稳定于“亚健康”状态，只有少数患者向危机生命的重症状态发展。 2.乙肝的传染性不象人们想象的、传说的那样可怕，其传染性虽然广泛存在，但其传染性的危害是有限的，不会造成爆发和流行，传染性的最大受害者、传染性威胁的最大人群是胎儿、婴幼儿和儿童，乙肝病毒对成人难以构成威胁。乙肝病毒的传染威力的大小和被感染者的年龄呈反比，被感染者的年龄越小，传染成功的几率越高，胎儿在孕妇子宫中被感染，称为乙肝病毒的宫内感染，宫内一旦感染，几乎百分之百地成为慢性病毒携带者，并且这种病毒感染往往根深蒂固，很难去根；新生儿分娩时一旦感染乙肝病毒，如果不及时给予乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白注射，病毒也可长驱直入，留下终生的隐患；反过来看，一个成人感染乙肝病毒，仅有不到5%的人会被感染成功，绝大多数的成人完全可以凭借自身正常的免疫机制，“御敌于国门之外”，及时清除和消灭乙肝病毒，使其没有藏身之地。我国如此众多的乙肝来源于何处？基本都是自幼感染，途径是母婴或父婴垂直传播，也有少部分通过医疗途径（输血、输液、镶牙、针灸等等）被传染。 3.乙肝患者中绝大多数为病毒携带者和轻度的肝炎，预后良好，多半可以平安度过一生。我国乙肝人数虽多，但80%以上为病毒携带者和轻度肝炎，他们大多病情平稳或缓慢发展、肝脏病变静止或轻微，本人身体没有什么不适，如果不进行查体（招工、入学、参军、献血等），根本就发现不了，也可能在不知不觉中，平安度过一生。从目前各种权威性的研究结果看，病毒携带者和轻度的慢性肝炎预后多是良好的，他们最终可能死于和肝病无关的一些疾病，因此属于这两种情况的患者应该尽量保持原有的健康的生活、工作方式，力求心理平衡、心态稳定，切忌乱用药物治疗。 4.的确有少数患者向活动性肝炎、肝硬化甚至于肝癌方向发展，其客观原因是遗传因素、机体免疫状态低下、病毒基因变异、叠加新的肝炎病毒等等；主观原因是患者自己折磨自己和胡乱用药。客观因素不以人们意志为转移；主观因素却是人为造成的，可以杜绝。所谓患者自己折磨自己，主要是指患者不能正确对待这个疾病：过于紧张者，寝食不安、惶惶不可终日，身心被受煎熬；过于乐观者，放任自流、酗酒纵欲，不加理会。再加上胡乱用药、轻信广告、旁人引诱，今天用这药、明天用那药，恨不能把天下治乙肝的药物用个遍，如此看来，病情加重，一半原因是客观造成的，另一半原因却是人为造成的，本来没有什么的普通疾病，经人为的胡乱折腾，也变成了缠绵不愈、病情恶化的顽疾。 5.目前治疗尚缺突破，但是预防措施却是十拿九稳，如果把预防放到首位，强制实施乙肝的计划免疫，我国乙肝的发病率将迅速下降，再过50年，乙肝“王国” 的帽子将被摘掉。回顾近百年的传染病史，20世纪初，天花、破伤风、脊髓灰质炎等等肆虐，各种药物都难以奏效，最终这些疾病逐渐灭绝，靠的不是治疗，而是预防，各种疫苗的问世加上强制性计划免疫的实施，彻底铲除了这些祸害，目前的乙肝也是一样，根除它的绝招就是乙肝疫苗的普种，这不单是理论上可行，而且实际操作也是相当容易，每人只需花30元钱，打上三只疫苗，以后就不会再得乙肝了。遗憾的是迄至目前，社会上下对乙肝预防的意义认识不足，虽然乙肝疫苗被纳入计划免疫，但是并非强制性的，从全国情况看，三分之二的人群尚未接种乙肝疫苗，但是对于乙肝的治疗却格外热中，治疗药物不断涌现，治疗费用一路攀升，治疗效果却始终不佳，这不能不说是一种舍本逐末、本末倒置的行为，如果不把乙肝的预防放在首位，预防工作不到位，再过50年，我国乙肝人数，仍然会居高不下，浪费的资金会更加惊人。 6.乙肝在广大百姓和患者心目中，犹如瘟疫；一旦发现自己乙肝澳抗为阳性，惊慌失措，东奔西跑，花冤枉钱胡乱治疗，几乎成为一种定式，为什么会这样？多分夸大乙肝的危害、威胁，过度渲染乙肝的传染性，无端限制乙肝患者升学、工作等等前程是导致这些异常的根本原因。乙肝是顽疾，也是普通的疾病，但是我国处理和对待该病的方式，以及媒体宣传的内容值得反思和深究，发达国家，如日本、新加坡；发展中国家，如泰国、马来西亚；以及我国的香港、台湾地区，乙肝发病率也不低，患者众多，但是他们对待和处理乙肝的方式和态度和我国有所不同，别国很少在媒体上渲染该病的可怕和恐怖，乙肝患者一般都在正常工作和学习，升学和工作并无特别限制，更见不到各式各样、五花八门的治疗，在香港，合法的、批准的治疗乙肝的药物只有几种，台湾也是如此，药物虽少，但发病率却在逐年下降，为什么？一是预防工作做得好，乙肝疫苗接种率高；二是没有乱七八糟的治疗药物，患者可以避免额外的药物性肝损害。我国也有同样例证，我国藏族同胞，四人中就有一人为乙肝，即没听说藏族同胞东奔西跑地治疗，也没听说藏民人均寿命受到过肝炎的威胁。携带乙肝病毒是我国国民常见、普遍的现象之一，必须实事求是看待这个问题，根治这一现象的唯一办法就是举国上下强制性普种乙肝疫苗，万不可治疗上步欧美后尘，在乙肝这个问题上形成“穷国高消费”的局面，我国乙肝市场极其火暴，洋药土药多如牛毛，只可惜广大患者劳民伤财，却总也看不到光明。这与我国目前存在对乙肝诸多认识的误区和误导有关，因此，很有必要还乙肝以本来面目，让所有患者知道真相，把乙肝当作一种普通的疾病看待，而不是一种“瘟疫”。

4. 干扰RNA的作用机制与应用前景是什么

RNAi历史

 

RNAi现象早在1993年就有报道： 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire 和 Craig Mello的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。

 

RNAi作用机理

 

大约200nt以上的长双链RNA能够进过RNAi途径在很多物种(如：线虫、果蝇、脊椎动物、植物等)沉默靶基因的表达。首先，这些双链RNA被Dicer酶(一种类RNase III酶)加工成20-25 nt的siRNA，而后这些siRNA被组装进入一种RNA依赖的沉默复合物。最后，这些siRNA与RNA分子互补配对，并引导RISC剪切、降解RNA分子。在哺乳动物中，>30nt的长双链RNA将引起潜在的抗病毒效应，引起非特异性RNA降解，抑制蛋白质合成。通过导入短片段(<25nt) siRNA可以避免哺乳动物的抗病毒效应，正确行使RNAi功能。

 

化学合成siRNA的优势

 

越来越多的研究人员开始采用RNAi技术研究基因功能组学，药物靶点筛选，细胞信号通路分析等。

RNAi药物研发进展

RNAi已经成为目前基因功能研究，药靶发现以及药物开发的基础，RNAi药物将有望成为的一种更为高效快捷的疾病治疗途径。siRNA在临床上应用必须克服技术上难题，主要包括改善siRNA药物动力学特性，避免脱靶效应和干扰素反应等。核酸化学和导入方面取得了巨大的进展，使得RNAi治疗法更具前景和潜能，RNAi药物势必大大推动临床药物开发进程，为临床治疗带来一场革命性变革。

过去的几年里，很多公司在RNAi领域都取得了很大的成就。初步统计，大约有19个公司正在开发85种siRNA药物，8个公司正在开发64种反义核酸药物。这些药物主要集中在癌症、肿瘤、心血管、眼部、抗病毒、呼吸道、抗菌、糖尿病等方面。目前Alnylan、默克、罗氏处于RNAi药物研究的第一阵营，其他大公司也都在开展siRNA药物的研发合作或独立研究。

RNAi药物实例

         2006年6月美国基因治疗学会年会上公布了世界首次 siRNA临床试验获成功这一振奋人心的消息。这项临床试验表明，靶向血管内皮生长因子（VEGF）基因的siRNA能够有效治疗老年性黄斑变性（AMD）。这项试验的成果是RNA疗法发展的一个里程碑，siRNA将在不久成为高效的分子药物应用于临床治疗。近年来，针对多种疾病的siRNA药物已经相继进入临床试验的不同阶段。大家可能注意到，绝大多数RNAi药物都是化学合成siRNA，原因存在多个方面：操作简便、可控；转染效率较高；对细胞毒副作用小；可进行各种修饰、连接；可大规模筛选；可大规模制备等。

    事实上，很多制药公司在RNAi上投入了大量的资源，以 siRNA 作为治疗手段的前景诱人， siRNA 从发现到现在短短几年的时间内，第一个 RNAi 药物 Bevasiranib （ Acuity 公司）已经诞生 , 用于治疗湿性老年性黄斑变性 (AMD) 。 

据报道：FDA已经批准了Quark药业用于肾移植病人的试验siRNA药物DGFi的新药临床试验申请。在2008年下半年，I期或II期临床试验已启动。

目前Alnylam是RNAi药物研发的领头羊，它的siRNA研究领域比较广，已经有一些RNAi药物在临床阶段，尤其是在抗病毒方面有的已经到临床三期了，预计RNAi药物五年内就可以上市了。Alnylam开发的 RNAi 药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等。siRNA作为药物会比一般小分子药物开发要快，选择性会更好，如果能够更好地解决药物靶细胞递送，相信可以治疗许多现在药物治疗效果不理想的疾病。

我国在创新药物方面的研究还远远落后于西方国家。而RNAi 技术的发展历史很短，是一项刚刚兴起不久的生物技术，虽然我们目前已经与发达国家有一定差距，但差距仅有几年的时间，如果我们加速发展，完全有条件赶超发达国家，有可能在一定时期内在创新药物开发方面取得突破性进展。特别是，利用这一技术可弥补我国在化学制药方面与发达国家之间的巨大差距。这一项新技术给我们带来了一个千载难逢的发展机遇。

5. ALN-VSP的奥尼兰姆公司

Alnylam是一家生物制药公司，基于 RNA干扰 或RNAi开发新颖的疗法。公司正在将其治疗方面的专门技术应用于RNAi，以满足重大的医疗需求，而目前的主要药物类别小分子或抗体药物无法满足其中的许多需求。Alnylam正在率先将RNAi转化为一类新的创新性药物，其同侪审评的研究成果已在全世界一流的科学杂志包括《自然》 、《自然药物》和《细胞》 中发表。公司正在运用这些能力，建立一种广泛的 RNAi疗法管道；其最前沿的计划是治疗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的二期人体临床试验，该试验与Cubist和Kyowa Hakko合作进行。此外，公司正在开发RNAi疗法，治疗多种疾病，包括肝癌、高胆固醇血症、亨廷顿舞蹈病和TTR 淀粉样变性病。公司在RNAi方面的基本专利、技术和专门知识上占据领先地位，从而得以与Medtronic、Novartis、Biogen Idec、Roche、Takeda、Kyowa Hakko Kirin和Cubist等首屈一指的公司结为主要联盟。为了反映公司对主要的科学、临床和商业倡议的看法，Alnylam在2008年1月建立“RNAi 2010”，包括公司的以下规划：显著扩展 RNAi疗法给药方法解决方案范围，拥有四个或更多的临床开发规划，建立四项或更多的主要业务新合作关系，所有这一切都在2010年年底之前完成。Alnylam和Isis共同拥有Regulus Therapeutics Inc.，Regulus Therapeutics Inc.侧重于微RNA疗法的发现、开发和商业化。Alnylam于2002年创建，总部设于麻省剑桥。

6. 我男朋友在过年前得了胃癌，他还小，大学还没毕业。。

可以先消业障 多放生  忏悔  有很多得了绝症的人 到医院发了很多钱（借的多）都没能治好  倒是回到家遇贵人 不怎么发钱就好了  医生见了都觉得奇怪 怎么没有死   。
俺有个亲戚70多岁了 年轻时身体里长了肿瘤  借钱跑遍省里各大医院  都没能治好 钱也发完了 不想再折腾 回家清净清净  没过多久呢 就做了一个梦 被菩萨从身后推了一下 第二天醒来后 他就吐出了个没鸡蛋大点的东西出来  很硬 他还拿铁锤 锤了锤 锤不碎 后来自然就没事了 不过他做了道士 十道九医 帮人治病什么的 应该不算久病成良医 他家有一打书 治病小法术 符咒之类的  上世纪七八十年代村里谁家闹鬼 或后天发精神病 都被他治好了 在乡下小时候见有些人家门上总贴着符 不知到原因挺吓人的  有一户人 家里呢就闹鬼 怎么回事呢  听说是屋里白天能见到鬼 穿白衣服 有时候地上还湿湿的 一两个人看见倒也不怪  关键是他亲戚啦 村里的人 很多到过他家都说有看到 后来就请了这亲戚写了几道符贴了贴  还好房子大 有左三间 右三间 闹鬼的是右边房间  所以小时候去他家玩 右边房间都没有人睡。见鬼是怎么回事呢   原来是盖房子的时候 要请木匠 石匠之类的嘛 可能伙食不好 被木匠动了手脚 说到木匠就要说鲁班公了 法术懂得多 民国之前 这些木匠 石匠都是一派一派 都会些 歪门邪道嘛 所以就在屋梁上动了下手脚 不过贴完符后 就再也没遇见过了  跑题了  类似故事 各村都有吧 

虽然地球人的寿命平均一百 还没有一直乌龟 一棵树来的长久 而且平均寿命还逐年减短 直到十岁
古代寿星有 老子 160岁 是《史记》保守估计   姜子牙岁寿139岁  鬼谷子 寿命约在110岁——130岁  中国长寿气功养生家李庆远 256岁  死于民国二十四年(1679-1935)  地球的吉尼斯纪录
天上的星星有很多 南斗星君主生  北斗星君主死 以及一些天灾  紫微星座也属于这一类  
可以学习诸葛亮借寿 点灯49盏 七七四十九天不灭之类 见道教北斗经    
 
美国公司宣布人类已经攻克癌症

合成的双链RNA进入肝细胞后，人体内的RNAi机制便会摧毁合成的RNA和任何与之匹配的、与肿瘤生长相关的信使RNA，阻止蛋白质的继续产生，从而使肿瘤停止生长.... 
据美国媒体报道，美国阿尔尼拉姆生物技术公司日前宣布他们找到了一种能够治愈所有癌症的新型药物，首批接受临床试验的19名晚期肝癌患者病情都有较大好转。不仅如此，该公司称，假以时日，这种药物甚至有可能治愈一切疾病。 
首批患者反应良好 
今年4月，19名接受化疗但没有好转的肝癌病人开始服用这种名为ALN-VSP的新型药物。服用第一剂后的数周内，药物就已经很明显地开始阻止肿瘤产生自身生长需要的蛋白质。 
到今年6月，阿尔尼拉姆公司称，通过“唤醒”人体自身的一种很少使用的免疫防御系统，ALN-VSP成功切断肝癌患者体内肿瘤62%的血流量。在治疗肝癌时，传统药物一般使用消除致病蛋白质的方法，而ALN-VSP则通过核糖核酸干扰(RNAi)疗法直接阻止细胞生成致病蛋白质。 
唤醒人体自身防御机制 
科学家在研究中还发现核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)之间一个奇妙的联系———如果说DNA对蛋白质来说是一张图纸，那么RNA就是能够下达指令的建筑商。RNA把DNA上的基因复制成单链的信使RNA，再由它向细胞传递信息继而产生蛋白质。 
1998年，科学家发现了核糖核酸干扰(RNAi)机制，原始生物就利用这个系统来甄别和摧毁病毒双链RNA和病毒信使RNA。研究人员发现，将一小段双链RNA引入细胞即能触发这一埋藏在人体内的古老机制，使RNAi再次发挥停止生产特定蛋白质的功效。从这一角度看，可以说RNAi具有治愈包括癌症在内的许多疾病的能力，这些疾病的特点一般都是由病变细胞产生过量的常见蛋白质所致。从理论上说，操控RNAi来杀死蛋白质并不难。比方说，ALN-VSP内就含有合成的双链RNA，它与肝脏肿瘤用于编码两种蛋白质的信使RNA相匹配，那两种蛋白质分别是促进肿瘤血管生长的血管内皮生长因子(VEGF)和加速肿瘤细胞快速分裂的纺锤体驱动蛋白(KSP)。 
合成的双链RNA进入肝细胞后，人体内的RNAi机制便会摧毁合成的RNA和任何与之匹配的、与肿瘤生长相关的信使RNA，阻止蛋白质的继续产生，从而使肿瘤停止生长。 
有望“包治百病” 
除了在癌症领域的应用，这项能攻击单个基因的技术还在其它医学领域掀起一阵RNAi疗法旋风。目前，阿尔尼拉姆公司已经将这种疗法用于亨廷顿氏舞蹈症、视网膜黄斑变性、肌肉萎缩和艾滋病等疾病的研究。
核磁共振扫描显示，使用ALN-VSP疗法后，肝脏肿瘤中的血流量明显减少 
加利福尼亚州知名分子遗传学家约翰?罗西称，RNAi疗法有望在两年内成熟。由于首批试验效果相当好，ALN-VSP有望成为首批基于RNAi理论而推向市场的药物。罗西表示：“我认为RNAi疗法对所有的病都有效。”

医学是疗病于已然  忽视防病于未然

7. RNAi 的机制及操作基本程序是怎样的？

1 RNAi的机制

  RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.

  RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态.

  由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代



2 双链RNA的构建 
双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al 用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.




RNA interference (RNAi) is a mechanism in molecular biology where the presence of certain fragments of double-stranded RNA (dsRNA) interferes with the expression of a particular gene which shares a homologous sequence with the dsRNA. RNAi is distinct from other gene silencing phenomena in that silencing can spread from cell to cell and generate heritable phenotypes in first generation progeny when used in Caenorhabditis elegans.

Before RNAi was well characterized, it was called by other names, including post transcriptional gene silencing and transgene silencing. Only after these phenomena were characterized at the molecular level was it obvious that they were the same phenomenon.

The use of RNA to reduce expression in plants has been a common procedure for many years. Single-stranded antisense RNA was introduced into plant cells that hybridized to the cognate, single-stranded, sense messenger RNA. While scientists first believed that the resulting dsRNA helix could not be translated into a protein, it is now clear that the dsRNA triggered the RNAi response. The use of dsRNA became more widespread after the discovery of the RNAi machinery, first in petunias and later in roundworms (C. elegans).


RNAi原理图解
http://lddljf.stedu.net/Article_Show.asp?ArticleID=1974


RNAi知识介绍powerpoint
1 http://www.biox.cn/content/20050519/13420.htm
2 http://www.biox.cn/content/20050519/13422.htm
3 http://www.biox.cn/content/20050519/13423.htm
4 http://www.biox.cn/content/20050519/13425.htm
5 http://www.biox.cn/content/20050519/13426.htm
6 http://www.biox.cn/content/20050519/13429.htm
7 http://www.biox.cn/content/20050519/13431.htm
8 http://www.biox.cn/content/20050519/13433.htm
9 http://www.biox.cn/content/20050519/13434.htm

8. 抗体封闭和sirna沉默的区别

RNA干扰及其应用进展
孙德惠1,2,才学鹏1*,常惠芸1 ,独军政1 
(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070)
摘 要:RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象.RNAi主要发生在核外,RNAi具有操作简便快速等特点.RNAi现象自发现至今已逾10年,在此期间,已将研究重点由机理研究转向应用研究.文章以RNAi的应用为重点,从RNAi的起源,可能的作用机制,作用特点,研究方法,应用前景及展望等方面进行了综述.
关键词:RNA干扰;双链RNA;基因沉默
RNAi是Napoli C D等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的.结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色.他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(cosuppression).之后,Ramano等在向粗糙孢菌(Neurospora crassa)中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling).Guo S等[2]发现正义RNA与反义RNA有相同水平的抑制效应,但未能就此现象给出合理的解释.Fire A等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA.至此,正式提出了双链RNA诱导的RNAi的概念,开启了RNAi研究的序幕.
1 RNAi可能的作用机制及特点
1.1 RNAi的作用机制
虽然RNAi作用的确切机制尚不清楚,但目前普遍认可是Bass假说.具体概括为三个阶段.
(1)起始阶段.在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA,即小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA).siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸.研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子,序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性;双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基;两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础. 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能[4] 
(2)引发阶段.siRNA与Argonaute蛋白家族及其他未知因素结合,形成siRNA-核蛋白复合物(siRNA-ribonucleoprotein complex,siRNP).siRNP在ATP及其他未知因素参与下,使双链siRNA解旋形成RNA诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC).RISC可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在,继而RISC在dsRNA的介导作用下与互补mRNA结合,并将其降解.mRNA被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing,PTGS)
(3)循环放大阶段.在siRNA诱导的RNAi过程中,可能还存在siRNA 的循环放大过程,以维持它的RNA诱导功能.此过程推测是以siRNA为引物,互补mRNA 为模板,在RNA依赖性RNA合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 的作用下,合成新的双链RNA,再由Dicer作用,产生新的siRNA,完成siRNA 的放大过程,开始新的RNAi循环[5].
关于对RNAi机制中重要酶的作用研究,Zamore P D等[6]发现,21 nt RNA指导mRNA的降解; Scharf W D等[7]发现ATP依赖的RNA解旋酶为Mut6;Grishok A等[8]发现Let-7和lin-4为内源性的RNAi基因(stRNA);Dalmay T等[9]提出RNA依赖的RNA多聚酶就是SDE-1; Bernstein E等[10]证实RNaseш样的核酸酶为Dicer; Elbashir S M等[11]应用外源性21 nt-siRNA能够抑制同源mRNA的表达;Novina C D等[12]证实无论是针对病毒感染细胞所需的CD4受体,还是针对病毒基因组的gag区域,siRNA都可以有效地使病毒与细胞的基因沉默,抑制HIV的感染与复制.
1.2 RNAi的作用特点
(1)"共抑制"性.RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转录,但不能正常积累mRNA;RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱导与其同源的内源基因沉默.
(2)高效性.试验证明双链RNA干扰mRNA 翻译的效率比单纯反义或正义RNA 的抑制效率提高了几个数量级;RNAi可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水平甚至完全"剔除",而产生缺失突变体表型.它比基因敲除技术更为便捷,科学家称RNAi技术为靶基因或靶蛋白的"剔降"(knockdown).
(3)高特异性.由dsRNA降解成的小干扰RNA,除其正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其余碱基在序列识别中都是必需的,单个碱基的改变即可使RNAi失效,RNAi能特异性降解mRNA,针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活.
(4)高穿透性.RNAi具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递和维持,如在含有双链RNA的溶液中,喂食表达双链RNA的细菌等,能向秀丽隐杆线虫导入双链RNA.
(5)"遗传性".已在线虫中观察到RNAi效应通过生殖系传递到后代,说明RNAi具有一定的可遗传性.
(6)高稳定性.细胞中可能存在天然的稳定siRNA的机制.此机制可能是siRNA与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性,这些双链RNA 不像反义核酸那样需要多种化学修饰来提高其半衰期.
(7)双干扰系统.哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径. 非特异性干扰反应是由大于30个碱基对的双链RNA介导,导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑制,RNA降解;特异性反应由21 bp～25 bp的小干扰RNA介导,可逃避非特异性干扰系统的"监控",只降解与其序列相应的单个基因的mRNA[11].
2 研究方法
在研究过程中,科研人员逐渐摸索总结出了成套的研究方法.目前,展开RNAi操作主要有两种方法.一种为直接将靶向特定基因的大约21个碱基长短siRNA,或45个~50个碱基的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)转染到细胞,shRNA在细胞中会自动被加工成siRNA,从而引发基因沉默或表达抑制.另一种为构建特定的siRNA表达载体,通过质粒在体内表达siRNA而引发基因沉默.此法的优点是排除了RNA酶干扰,延长siRNA半衰期.更重要的是,该法可以进行稳定表达细胞株的筛选,且随着质粒复制扩散到整个机体,基因抑制效果可传代.试验表明,可被化学合成或体外合成的siRNA抑制的基因同样可被表达相同序列的载体表达出的siRNA所抑制.
3 RNAi的应用
3.1 基因功能研究
在神经生物学研究中,科学家们通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制,还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型,不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记,对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义;在癌症研究中,通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因,同时对RNAi的远程(穿过血脑屏障)基因沉默方法进行了非常有益的探索;利用细胞凋亡途径,通过RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率,并发现Caspase 8 siRNA处理对特异性Fas激活剂(Jo2和AdFasL)和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效,表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制,增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望.除了对某些关键基因的RNAi研究外,还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法.他们建立了一个包含8 000多个基因的siRNA表达框文库阵列,通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因.由此可见,RNA干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具,发挥着越来越大的作用[13].RNAi为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径.通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制,研究者可以深入研究基因功能,进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络.
3.2 基因治疗及药物筛选探索
由于RNAi是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了新的途径.其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达.尤其针对引起一些对人类健康严重危害的病毒,如2003年在全球多个国家和地区流行的SARS,病原体是单链核酸的新型冠状病毒,寻找药物靶点,设计核酸药物就更为方便.目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物,如在SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVI BioPharma生物制药公司等.国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这方面的工作.如上海生科院成立了SARS防治科研攻关小组,其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNAi的角度努力.此外,北京大学,中南大学,北京动物所等大专院校和研究机构,以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等,也开展了RNAi药物的研究与开发.
基因治疗方面最引人注目的进展之一是对肝炎病毒的RNAi研究.Mccaffrey A P等通过表达shRNA的载体在细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制.与对照相比,小鼠血清中测得的HBsAg下降了84.5%,免疫组化对HBcAg的分析结果下降率更超过99%.哈佛大学Lieberman研究小组通过注射针对Fas的siRNA,过度激活炎症反应,诱导小鼠肝细胞自身混乱.然后给测试小鼠注入 Fas hyperdrive的抗体,发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭,而82%的siRNA处理小鼠都存活下来,其中80%~90%的肝细胞结合了siRNA.并且,RNAi发挥功能达10 d,3周后才完全衰退.由于Fas很少在肝细胞外的其他细胞高水平表达,它对其他器官几乎没有副作用.此外,这个小组还和其他研究者积极开展针对HIV的RNAi测试,目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约3周,在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制.
然而,尽管取得了不少研究成果,但要真正用于医疗还需时日.目前大多数还停留在小鼠测试阶段,siRNA的导入多采用静脉或腹腔注射,尾部注射,细胞移植等,如何对人进行有效的给药,既能确保药效在靶器官靶组织有效释放,还要具有高度安全性等问题都需进一步研究.人们期待着RNAi引领的新医学革命的到来.
在药物筛选领域,除了线虫这种低等动物的RNAi高通量药筛模式外,Lavery K S等对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价,RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具.他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望,并指出将这项技术与高通量筛选,体外生物检测和体内疾病模式相结合,将提供大量基因功能方面的有用信息,在药物开发过程的多个阶段促进靶点的有效筛选.
3.3 抗肿瘤治疗
多种癌基因可以作为靶点设计相对应siRNA[14].Brummelkamp T R等[15]用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因K2RAS (V12)的表达.对急性髓性白血病的研究已经取得了较好的结果.Scherr M等[16]以引起慢性髓性白血病和bcr2abl阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr2abl癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87% 的有效抑制率.Wilda M等[17]用siRNA抑制白血病BCR/ABL融合基因表达也取得了成功. 因此,基于RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大.有报道称,一种全新生物工程药品"RNA干扰剂"(非干扰素)业已浮出水面,并有望在3年内上市.经过多年的探索,科学家终于发现,在癌细胞和病毒RNA的22对碱基中有1对碱基专门负责复制工作,只要能使这对碱基"休眠",癌细胞或病毒就会自动停止复制.这一重要发现为一种全新药物——RNA干扰剂奠定了基础.科学家们相信,艾滋病,乙型肝炎,恶性胶质瘤(恶性脑瘤)和胰腺癌等疾病有望成为RNA干扰剂的第一批受益者(2004年经FDA批准已开始RNA干扰剂的临床试验),艾滋病,中枢神经系统退行性病变疾病如多发性硬化症,阿尔茨海默病,帕金森病等将成为第二批受益者.
3.4 抗病毒治疗
由于RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制,目前国外科技人员利用此特点,已设计出针对HIV gag,tat,rev,nef等基因的siRNA,针对丙型肝炎病毒非结构蛋白5B基因的siRNA,针对脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白和多聚酶基因的siRNA,针对口蹄疫病毒3D片段siRNA等[18],均在试验中取得理想结果.陆续有关通过RNAi抑制其他病毒在细胞内复制的报道如呼吸道合胞病毒,人乳头瘤病毒,乙型肝炎病毒,丙型肝炎病毒[19]等,国内也已设计出针对口蹄疫病毒VP1基因的siRNA,针对丙型肝炎病毒5′保守区的siRNA,针对口蹄疫病毒IRES和L串联序列两侧的保守区的siRNA[20],针对SARS冠状病毒的6个siRNA,即RL001,R L002,RL003,RL004,RL005和RL006,均已取得理想结果.针对病原的siRNA已经进行到动物实验阶段[21],向病毒病的有效防治迈出了坚实的一步.由此可见,利用RNAi技术将使病毒病的有效治疗成为可能.
3.5 转基因研究
在动植物的转基因试验中, 经常发生基因沉默.因此, 对转基因沉默机制的探索可以为在转基因研究中避免基因沉默提供对策.在转基因植物研究中避免基因沉默可提高试验成功率,且节省时间,而在大型动物转基因研究中避免基因沉默可节约成本,提高产率.
3.6 干细胞研究
在干细胞研究方面,在dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞 Hes5表达的试验中[22],观察外源性短dsRNA在转录后水平mRNA水平降低基因表达的效率,并对其影响因素进行了初步探讨.同时基于干细胞可能拥有自己的一套基因组,不同类型的干细胞又拥有各自所特有的基因,这些基因可能是决定干细胞特性的最关键的实质性因素.因此,RNAi技术在此领域应用空间广阔.
3.7 研究信号传导的新途径
Biotech认为,联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果.RNAi技术较传统的转染试验简单,快速,重复性好,克服了转染试验中重组蛋白特异性聚集和转染率不高的缺点,因此认为RNAi技术可能成为研究细胞信号传导通路的新途径.
3.8 常见病的治疗
Nature杂志报道了miRNA(Micro RNA)的应用上一个重要发现,成功采用miRNA调节了胰岛素的分泌,这为糖尿病的治疗带来新的希望,也将为糖尿病的新药研究带来新的曙光和思路.据Sicence杂志报道,显示应用RNAi技术可有效降低血管内胆固醇含量,对治疗心血管疾病有明显的作用.
4 展望
综上所述,RNAi技术在基因功能研究,抗肿瘤治疗,抗病毒治疗,基因应用研究,常见病的治疗等许多方面都是强有力的工具和手段.同时做为新兴的生物技术,还有广阔的研究和应用空间期待着科研人员的探索.例如,siRNA在病毒持续性感染过程中扮演怎样的角色 siRNA在冬眠动物体内的作用如何 RNAi在雀斑形成中起到怎样的作用 如上述问题得到解决,将进一步依据其机理及特点,有望应用于病毒持续性感染的鉴别诊断及治疗,利用siRNA在冬眠动物体内的作用进行星际航行,以解决能量供应及时间跃迁问题,RNAi应用于祛除雀斑等.aware可自测不用抽血祝您健康天 猫！
尽管在RNAi方面的研究已取得许多突破性进展,尤其是哺乳动物细胞中的研究的报道逐渐增多,但由于RNAi机制尚未完全阐明,仍有许多问题尚未得到彻底解答.例如,siRNA 在哺乳动物细胞中抑制mRNA表达是有效的, 但达不到果蝇细胞那样的高抑制率, 可能是因为生物进化水平越高,调控基因表达系统的复杂程度相应的越高,多种抑制机制间相互作用的频率也越高,抑制作用受到的影响因素也就越多.另外, 在哺乳动物中,RNAi能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型.对线虫来说,可以采用注射,浸泡或喂食的方法转入dsRNA,而对哺乳动物来说,寻找高效的方式来转入siRNA以及快速的方式来筛选siRNA仍在进一步探索中.RNAi在抗病毒感染中的应用令人鼓舞, 但要取得最终的成功还有很漫长的路要走.其中一个关键的原因是siRNA并不能对所有病毒RNA发生作用,有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下, 或者位于高度折叠的区域中, 而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物, 阻碍了与siRNA 的识别.因此,不仅要选合适的靶序列,而且需要反复试验.另一个重要的原因是病毒子代的突变率较高, 这使病毒可逃避siRNA 的识别.为了克服这个障碍,所选病毒RNA的靶序列必须是高度保守的, 或者设计数对siRNA同时作用[23].
总之,RNAi作为一种新发展起来的分子生物学技术,不可避免地会存在潜在的问题,这就要求研究者在利用该技术时要考虑到生物安全性等诸多问题,以使RNAi技术更好地为人类服务.